A los cinco años de edad, Diego fue acogido por su padre, pero este murió al poco tiempo, debido a lo cual quedó al cuidado de su tío materno, Hernán Gutiérrez, de cuya casa huyó a la edad de 15 años.

Su triste y solitaria niñez, y una juventud incierta, no le permitieron estudiar; no sabía leer ni escribir, lo que no oscurece las virtudes que le reconocen los cronistas: honrado, franco, generoso y de gran ánimo. Según Cieza de León, Diego de Almagro "era de pequeño cuerpo, de feo rostro e de mucho ánimo, gran trabajador, liberal aunque con jactancia, de gran presunción, sacudía con la lengua algunas veces sin refrenarse. Era avisado y sobre todo muy temeroso del rey".

Participó en las empresas de Conquista de Panamá y el Perú. Desde este último territorio emprendió en 1535 la exploración de Chile.

Almagro llegó a América en 1514, con la expedición que, bajo el mando de Pedrarias Dávila ( o Pedro Arias de Ávila), conquistó Panamá. Allí conoció a Francisco Pizarro, quien llegaría a ser su socio en una serie de proyectos, siendo el más grande de ellos la Conquista del Perú, a donde llegaron en 1532. En la formación de esta empresa también intervino Hernando de Luque, clérigo que prestaba sevicios en Panamá y el que invirtió una gran cantidad de dinero en el proyecto.

Es importante señalar que todas las empresas conquistadoras de América eran financiadas por sus propios integrantes y que, eventualmente, el Estado podía realizar algunos aportes, pero siempre en especies, nunca en dinero.

La amistad entre Pizarro y Almagro empezó a quebrarse en 1526 cuando el primero, a nombre de todos los inversionistas, firmó con el Rey la Capitulación de Toledo. Esta era un instrumento mediante el cual la Corona autorizaba la Conquista del Perú y se fijaban las recompensas que cada uno de los socios recibiría. Con anterioridad, estos se habían comprometido a repartir equitativamente los beneficios; sin embargo, al tratar con las autoridades hispanas, Pizarro logró para sí una mayor cantidad de premios y títulos. A pesar de ello, Almagro obtuvo de todos modos una importante fortuna, y por sus servicios el Rey se le concedió (en noviembre de 1532) el tratamiento de don y se le asignó un escudo de armas.

Deseando alcanzar mayor prestigio, en 1534 Almagro obtuvo la gobernación de Nueva Toledo, la que según la Capitulación que su representante había firmado con Carlos V, comprendía las tierras ubicadas entre los paralelos 14 y 25 de latitud sur, es decir, desde El Cuzo hasta Taltal. Según los indígenas, estas tierras eran abundantes en oro, lo que justificaría cualquier esfuerzo.

Almagro demoró 6 meses en alistar su expedición. No tuvo problemas en conseguir a los hombres, que mandó reclutar en El Cuzco y en Lima. Con su fortuna personal equipó a los soldados que no tenían recursos. Se compraron armas, herramientas, herraduras, pólvora, y otros utensilios necesarios. En total, se calcula que la empresa habría costado un millón y medio de pesos castellanos.

Cuando Almagro salió hacia Chile, el 3 de julio de 1535, quedaba pendiente en el Perú la disputa con Pizarro por la ciudad del Cuzco, que ambos creían entraba en su gobernación.

La ruta utilizada por Almagro para conducir a su hueste (integrada por alrededor de 500 españoles, 100 esclavos negros y 10.000 indígenas) pasaba por el Altiplano boliviano, bordeando el río Titicaca para llegar a Paria, Tupiza y desde ahí a Chicoana, girando luego hacia el suroeste para cruzar la Cordillera de los Andes por el paso de San Francisco.

El camino fue duro y extenuante. La fase más difícil fue el cruce de la cordillera: a casi 4.000 metros de altitud, el frío, el hambre y el cansancio significaron la muerte de españoles e indígenas, pero mayoritariamente de los esclavos, poco acostumbrados a climas tan rigurosos. La tradición dice que en algunas ocasiones algún soldado se detenía a descansar y moría congelado; que otro, al sacarse una de sus botas vio con horror como los dedos de sus pies estaban pegados a ella.

Entonces, una oportuna decisión de Almagro salvó lo que ya era un fracaso: ordenó a un pequeño grupo que se adelantase en el camino y buscase auxilio entre los indígenas. Por fortuna, estos hombres encontraron en el Valle de Copiapó a un español llamado Gonzalo Calvo Barrientos, un delincuente que había sido castigado por sus fechorías cortándosele las orejas y que ayudó a los expedicionarios gracias a sus vínculos con los naturales de la zona. Allí, en el valle del río Copiapó, Almagro tomó posesión de Chile a nombre de Carlos V.

Diego de Almagro emprendió la exploración del territorio, dirigiéndose hacia el valle del río Aconcagua donde fue bien recibido por los indígenas. Sin embargo, las intrigas de su intérprete, un indígena llamado Felipillo, convencieron a los naturales de que la intención de Almagro era asesinarlos. Felipillo instó a los indígenas a atacar a los españoles por sorpresa, pero aquellos se desistieron.

Con el propósito de seguir el reconocimiento de las tierras y encontrar las riquezas de las cuales le habían hablado, Almagro organizó la expedición al Sur. Para ello envió a Gómez de Alvarado, quien junto a 70 hombres de a caballo avanzó sin encontrar mucha resistencia (julio-septiembre de 1536), llegando a la confluencia de los ríos Ñuble e Itata. En ese lugar, se produjo el primer enfrentamiento armado entre españoles y mapuche, la Batalla de Reinohuelén.

En forma paralela, Almagro envió a Juan de Saavedra a reconocer las costas en la embarcación que le había traído refuerzos desde el Perú. Saavedra alcanzó hasta la zona de Alimapu, que llamó Valparaíso

(que quiere decir Valle del Paraíso). El reconocimiento que el mismo Almagro hizo de la región central y las negativas noticias de Gómez de Alvarado, le hicieron pensar que quizás las riquezas se encontraban más allá de esa inmensa cordillera. Sin escuchar consejos decidió, en pleno invierno, enviar una expedición que al segundo día de marcha decidió volver; la empresa era irrealizable.

Diego de Almagro no encontró oro ni ciudades, sólo comunidades indígenas agricultoras y otras más belicosas en el Sur; no obstante esto, pensó en quedarse e incluso en fundar una ciudad. El optimismo inicial había hecho que Almagro trajera a estas tierras al hijo nacido de su relación con la indígena panameña Ana Martínez, el que también debía servir al Rey. Su primera intención fue quedarse; si no hubiera sido por las recomendaciones de sus compañeros de empresa (quienes lo instaron a volver al Perú a tomar definitiva posesión de su cargo, para asegurar la herencia de su hijo), quizás Almagro habría emprendido la Conquista del país. Fue así como, decidido a volver al Perú, inició el viaje de regreso en septiembre de 1536.

La salida de los españoles de los valles de Chile fue violenta: Almagro autorizó a sus soldados a saquear a los indígenas, dejando sus tierras desoladas; no hubo ni un solo español que no tomara naturales para su servicio. Los amarraban y los obligaban a cargar sus pertenencias, actuando sin ninguna compasión.

De manera unánime, se decidió tomar la ruta del Desierto de Atacama. Antes de partir, Almagro, en un acto de gran generosidad, juntó a sus hombres y delante de ellos rompió las escrituras que documentaban las deudas contraídas con él antes de partir del Cuzco. Con este gesto quería recompensar, aunque fuera en una mínima parte, la ayuda recibida de estos toscos y ambiciosos aventureros.

La travesía del desierto no fue fácil debido a las condiciones climáticas imperantes; al igual que en el trayecto que habían realizado por el Altiplano, los conquistadores obtenían los alimentos de los indígenas, fuera de buena o mala forma.

Finalmente, la expedición llegó al Cuzco (1537). Según algunos autores, aquí nació la figura del roto chileno, debido, fundamentalmente, a las condiciones en que la hueste de Almagro arribó a su lugar de partida, con sus ropas hechas jirones y prácticamente deshecha.

La ciudad estaba sitiada por tropas indígenas al mando del Inca Manco II. Almagro era amigo del Inca, razón por la que le solicitó una entrevista, pero el encuentro no fue posible. Temiendo un entendimiento entre Almagro y Manco, el Gobernador Hernando Pizarro sembró la desconfianza entre los sitiadores, quienes atacaron la ciudad. Las tropas de Almagro se dispersaron, pero con los hombres que se quedaron a sus órdenes, logró poner fin al cerco, apresando a los hermanos Hernando y Gonzalo Pizarro.

Luego de ocupar El Cuzco, Almagro derrotó a los soldados enviados por Francisco Pizarro, que estaban al mando de Alonso de Alvarado, en la Batalla de Abancay (12 de julio de 1537); más tarde, Gonzalo Pizarro y Alvarado lograron escapar del lugar donde se les mantenía prisioneros.

Las negociaciones posteriores entre Francisco Pizarro y don Diego concluyeron en la entrega del Cuzco a Almagro, a cambio de la libertad de Hernando Pizarro. Don Francisco no cumplió con su parte, rompió el acuerdo y con un ejército que había organizado durante ese tiempo, atacó a las fuerzas almagristas. El Conquistador, ya enfermo, fue derrotado en el campo de las Salinas, cerca del Cuzco el 6 de abril de 1538. Tomado prisionero, fue condenado al garrote y su cadáver fue llevado a la plaza pública donde se lo decapitó, el 8 de julio de 1538.